Die Proteomanalyse umfasst eine umfassende Untersuchung aller Proteine in einem Organismus, einem Gewebe oder einer Zelle, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Struktur, Funktion, ihrem Expressionsniveau und ihren Wechselwirkungen liegt, um ihre dynamischen Veränderungen und molekularen Mechanismen in biologischen Prozessen aufzudecken. Die Proteomanalyse umfasst die Identifizierung von Proteinen, die quantitative Analyse, den Nachweis posttranslationaler Modifikationen (PTM), die Analyse von Proteininteraktionsnetzwerken und die Analyse der Anreicherung funktioneller Signalwege, um ein umfassendes Verständnis der Rolle von Proteinen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu ermöglichen.
Die Proteomanalyse kann die Verbindung zwischen Genen und Phänotypen aufdecken, die wichtigsten molekularen Mechanismen aufklären, die dem Auftreten, dem Fortschreiten und der Behandlung von Krankheiten zugrunde liegen, und potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele identifizieren. Mit Hilfe hochauflösender Massenspektrometrie-Technologien und fortschrittlicher Bioinformatik-Tools stellt sich die Proteomanalyse wissenschaftlichen Herausforderungen wie der Analyse molekularer Krankheitsmechanismen, der Identifizierung von Arzneimittelzielen und der Entdeckung von Biomarkern und bietet eine solide Unterstützung für die Präzisionsmedizin, die Arzneimittelentwicklung und die Grundlagenforschung in den Biowissenschaften.
1. Quantifizierung von Proteinen
Bei der quantitativen Proteomik unterscheidet man zwischen markierungsbasierten und markierungsfreien Methoden. Bei der markierten quantitativen Proteomik werden leichte und schwere Isotope oder chemische Markierungen in die Proben eingebracht, um die Proteinhäufigkeit unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen. Bei der metabolischen Markierung (z. B. SILAC) werden markierte Aminosäuren verwendet, die während der Zellkultur eingeführt werden, um Proteine metabolisch zu markieren, während bei der chemischen Markierung (z. B. ICAT) bestimmte Rückstände mit speziellen chemischen Markierungen modifiziert werden. Bei der enzymatischen Markierung werden während des Verdauungsprozesses unter Verwendung von schwerem Wasser 18O-Isotope eingebaut. Nach der Markierung werden die Proben in festen Verhältnissen gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert, um die relative Proteinhäufigkeit auf der Grundlage der Unterschiede in den Signalintensitäten der Massenpeaks zu quantifizieren. Markierungsbasierte Methoden bieten eine hohe Präzision und Reproduzierbarkeit und sind daher ideal für quantitative Studien in komplexen Proben. Die markierungsfreie quantitative Proteomik erfordert keine zusätzliche Markierung der Proben und quantifiziert direkt die relative Proteinhäufigkeit durch Analyse der Unterschiede in den Peptid-Signalintensitäten oder der Anzahl der Spektren mittels Massenspektrometrie. Nach dem separaten Verdau und der massenspektrometrischen Analyse jeder Probe wird die relative Häufigkeit der Proteine durch den Vergleich der Signalintensitäten derselben Peptide unter verschiedenen Bedingungen berechnet. Die markierungsfreie Methode hat einen einfacheren Arbeitsablauf und eignet sich für große Proben oder Experimente, bei denen eine Markierung unpraktisch ist.
2. Protein-Identifizierung
Die Proteinidentifizierung nimmt eine zentrale Stellung in der Proteomanalyse ein, da sie als Grundlage für das Verständnis der Zusammensetzung, Struktur und Funktion von Proteinen in biologischen Systemen dient. Der Arbeitsablauf der Proteinidentifizierung besteht aus mehreren Schlüsselschritten. Zunächst werden die Proteine aus biologischen Proben wie Tieren, Geweben, Bioflüssigkeiten oder Zellen extrahiert. Anschließend wird eine Proteintrennung durchgeführt, um eine effektive Differenzierung der verschiedenen Proteine zu gewährleisten. Anschließend werden die Proteine durch einen proteolytischen Verdau mit Enzymen wie Trypsin in Peptide aufgespalten. Anschließend kann eine chemische Markierung (ein optionaler Schritt) vorgenommen werden, um die Genauigkeit der quantitativen Analyse zu erhöhen. Die resultierenden Peptide werden dann mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert, wobei Massenspektren erzeugt werden. Diese Spektren werden für die Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden verwendet, die wiederum der Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen zugeordnet werden. Durch den Einsatz hochpräziser Massenspektrometrie-Technologien und fortschrittlicher Bioinformatik-Tools werden bei der Proteinidentifizierung Veränderungen in der Proteinexpression, posttranslationale Modifikationen und Protein-Protein-Wechselwirkungen unter bestimmten Bedingungen aufgedeckt, was wichtige Daten für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, die Entdeckung von Biomarkern und das Screening von Arzneimittelzielen liefert.
3. Analyse der posttranslationalen Modifikation von Proteinen
Ausgehend von diesem Diagramm folgt der Arbeitsablauf der Analyse posttranslationaler Modifikationen (PTM) hauptsächlich drei Strategien: Bottom-up-Proteomik, Middle-down-Proteomik und Top-down-Proteomik. Bei der Bottom-up-Proteomik werden die Proteinproben einem hochgradigen Verdau unterzogen, um kleine Peptide (8-30 Aminosäuren) zu erzeugen. Diese Peptide werden mittels LC-MS aufgetrennt und ausgewählt, gefolgt von einer MS2-Analyse zur Identifizierung von PTM-Stellen. Bei der Middle-down-Proteomik werden Proteine einem mittelschweren Verdau unterzogen, um größere Peptide (>30 Aminosäuren) zu erzeugen. Diese Peptide werden mittels LC-MS aufgetrennt, selektiert und mit MS2 analysiert, wobei mehr Sequenz- und Modifikationsinformationen erhalten bleiben. Bei der Top-down-Proteomik bleiben die Proteine unverdaut und werden als intakte Einheiten analysiert. Sie werden einer Proteintrennung, einer Proteoformauswahl und einer anschließenden Analyse mittels MS1 und MS2 unterzogen, was die Identifizierung verschiedener Proteoformen und PTM-Muster ermöglicht. Bei der PTM-Identifizierung wird die gemessene Peptidmasse mit der theoretisch berechneten Sequenzmasse verglichen. Anhand der Massenverschiebung (Δm) werden spezifische Modifikationen (z. B. Acetylierung, Δm = 42,01 Da) identifiziert und mithilfe von PTM-Datenbanken validiert. Durch diesen umfassenden Arbeitsablauf werden PTM-Stellen, Typen und ihre biologische Rolle genau identifiziert und Regulationsmechanismen in zellulären Prozessen aufgedeckt.
4. Protein-Protein-Interaktionsanalyse
Die Proteininteraktionsanalyse ist ein entscheidender Ansatz zur Aufdeckung von Proteinfunktionen und regulatorischen Netzwerken in Zellen. Im Folgenden werden drei Hauptstrategien vorgestellt:
(a) Affinitätsaufreinigung: Mit Hilfe von Antikörpern oder Tags (z. B. Strep-Tag, TAP-Tag) werden Zielproteine (Bait) zusammen mit ihren direkten oder indirekten Interaktionspartnern aus Zelllysaten angereichert. Diese Komplexe werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode eignet sich besonders für die Analyse stabiler Proteinkomplexe.
(b) Näherungsmarkierung: Techniken wie BioID oder APEX werden eingesetzt, um benachbarte Proteine in einem bestimmten Umkreis um das Zielprotein mit Biotin kovalent zu markieren. Diese mit Biotin markierten Proteine werden dann über Streptavidin gereinigt und mittels Massenspektrometrie identifiziert. Dieser Ansatz ist ideal für die Erfassung schwacher oder flüchtiger Proteininteraktionen.
(c) Globale Interaktomanalyse: Die Proteine werden durch Fraktionierungstechniken (z. B. SEC, IEX) oder thermische Proximity-Koaggregationsanalyse global analysiert. Diese Methoden ermöglichen die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinkomplexen in großem Maßstab. Schließlich werden Massenspektrometrie und Bioinformatik eingesetzt, um die Daten zu integrieren und ein umfassendes Proteininteraktionsnetz (Interactome) zu erstellen, das dynamische Proteininteraktionen in komplexen biologischen Prozessen aufzeigt.
5. Proteomik-Analyse von Proben
Die Proben-Proteomik-Analyse umfasst eine umfassende Untersuchung der Zusammensetzung, Struktur und Funktion von Proteinen in einer Probe. Zunächst wird eine Proteinextraktion durchgeführt, um die Gesamtproteine aus biologischen Proben wie Zellen, Gewebe oder Bioflüssigkeiten zu isolieren, wobei die Integrität und hohe Qualität der Probe gewährleistet wird. Anschließend wird ein Proteinverdau durchgeführt, in der Regel mit Trypsin, um die Proteine in spezifische Peptide aufzuspalten, was die anschließende Analyse erleichtert. Darauf folgt die MS/MS-Analyse, bei der die Peptide mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) getrennt, identifiziert und quantifiziert werden. Anschließend erfolgt die Datenanalyse mit Hilfe spezieller Bioinformatik-Tools zur Interpretation der Massenspektrometriedaten und zur Identifizierung und Quantifizierung der Proteine. Schließlich werden die experimentellen Ergebnisse in einem Bericht zusammengefasst, der Muster der Proteinexpression, Interaktionen und funktionelle Veränderungen in biologischen Prozessen aufzeigt. Die Proteomanalyse von Proben bietet robuste technische Unterstützung für die Erforschung von Krankheitsmechanismen, die Entdeckung von Biomarkern und die Identifizierung von Arzneimittelzielen.
